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細(xì)胞培養(yǎng)指南——技術(shù)和方案

更新時間:2021-05-19   點擊次數(shù):2293次

細(xì)胞培養(yǎng)指南——技術(shù)和方案

哺乳動物細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)指南。涵蓋大量關(guān)于哺乳動物細(xì)胞系的維持、分裂和細(xì)胞保存的信息。請注意,所有細(xì)胞培養(yǎng)必須使用無菌技術(shù)在層流罩中進(jìn)行。

1.引言

細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)中使用的關(guān)鍵工具,可以對細(xì)胞的生理學(xué)和生物化學(xué)進(jìn)行建模。此外,細(xì)胞培養(yǎng)使研究人員能夠確定藥物和有毒化合物對細(xì)胞反應(yīng)的影響。由于使用一批克隆細(xì)胞可獲得一致和可重復(fù)的結(jié)果,細(xì)胞培養(yǎng)仍然是當(dāng)今研究中使用*泛的技術(shù)之一。

來自動物或植物的細(xì)胞在有利環(huán)境中的生長被稱為細(xì)胞培養(yǎng)。不同的細(xì)胞有不同的培養(yǎng)要求,為了達(dá)到最佳的生長效果,可以通過培養(yǎng)基的選擇和補充劑來滿足。所用介質(zhì)的作用是提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì))、生長因子、激素、氣體(O2、 CO2),并調(diào)節(jié)物理化學(xué)環(huán)境(pH值、滲透壓、溫度)。

1.2 原代培養(yǎng)vs細(xì)胞系

原代培養(yǎng)是指在組織分離后直接進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞。一旦這些細(xì)胞匯合,即會占據(jù)燒瓶中所有可用空間,此時就需要將它們轉(zhuǎn)移到一個新的生長容器中進(jìn)行傳代或分割,這將為細(xì)胞提供更多的繼續(xù)生長和擴展的空間。第一次傳代后,原代培養(yǎng)現(xiàn)在成為所謂的細(xì)胞系。源自原代培養(yǎng)的細(xì)胞系壽命有限,這意味著它們在衰老之前只能分裂有限的次數(shù)。

由于細(xì)胞被傳代,生長能力*的細(xì)胞占優(yōu)勢,導(dǎo)致群體的基因型和表型一致。永生細(xì)胞系廣泛用于細(xì)胞和分子生物學(xué),以繞過衰老等問題。細(xì)胞可以通過多種不同方式轉(zhuǎn)化并永生。自發(fā)地、化學(xué)地或病毒地。一旦轉(zhuǎn)化,這些細(xì)胞就獲得了無限分裂的能力,成為一個連續(xù)的細(xì)胞系。

1.3 貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞

細(xì)胞系可以是:

1.貼壁(貼壁依賴性)——貼壁細(xì)胞必須在附著于固體或半固體底物上時進(jìn)行培養(yǎng),通常需要胰蛋白酶法進(jìn)行亞培養(yǎng)(更多信息請參見2.6)。

2.懸浮(與錨固無關(guān))——懸浮細(xì)胞不需要固體生長底物,可以懸浮在培養(yǎng)基中生長。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)指南

以下是細(xì)胞系培養(yǎng)的通用指南。所有細(xì)胞培養(yǎng)必須在微生物安全柜中進(jìn)行,使用無菌技術(shù)確保無菌。研究人員必須全程穿著防護(hù)服。

2.1 無菌技術(shù)和層流罩的制備

良好的無菌技術(shù)旨在創(chuàng)建無菌環(huán)境,并充當(dāng)微生物與無菌細(xì)胞培養(yǎng)罩之間的屏障。該技術(shù)的關(guān)鍵包括使用無菌試劑和培養(yǎng)基。無菌操作確保未經(jīng)過70%乙醇噴灑過的任何物體進(jìn)入罩內(nèi)。

層流罩制備

細(xì)胞培養(yǎng)罩可提供無菌工作區(qū),同時可確??刂莆⑸锍绦虍a(chǎn)生的任何傳染性飛濺物或氣溶膠。細(xì)胞培養(yǎng)罩有3種類型,分別為I級、II級和III級,這些都是為了滿足不同的研究和生物安全需求而開發(fā)的。請根據(jù)實驗需求選擇合適的產(chǎn)品。

使用層流罩

步驟程序

1.

取下蓋子并打開層流罩。

2.

將層流罩窗扇關(guān)閉至適當(dāng)位置,以保持層流空氣。

3.

用70%的乙醇噴灑層流罩的所有表面區(qū)域。

4.

避免混亂。

5.

確保所有使用的設(shè)備(即移液器吸頭、移液器、機架、Eppendorf管、燒瓶、試劑)是無菌的,然后再把它們放在罩子里。這可以通過高壓滅菌或通過使用購買的預(yù)高壓滅菌的不含DNAse / RNAse的設(shè)備來完成。用70%乙醇噴灑移液器和機架。

6.

所有介質(zhì)、補充劑和試劑必須無菌,以防止微生物在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長。如果一些試劑和補充劑沒有提供無菌,將需要對它們進(jìn)行過濾消毒。

7.

避免直接從瓶或燒瓶中倒入介質(zhì)和試劑。

8.

每個移液器只使用一次,以避免交叉污染。

9.

在準(zhǔn)備使用移液器,并在罩內(nèi)進(jìn)行之前,不要拆開無菌移液器的包裝。

10.

只有在準(zhǔn)備使用時才可以揭開無菌燒瓶、瓶子、培養(yǎng)皿等的蓋子,切勿讓其暴露在環(huán)境中。使用完后應(yīng)立即將蓋子放回原處。

11.

如果要取下蓋子,并且必須將其放在工作面上,則將蓋子的開口朝上放置。

2.2 細(xì)胞生長培養(yǎng)基的制備

在開始之前,確保針對感目標(biāo)細(xì)胞系使用正確的培養(yǎng)基類型和培養(yǎng)補充劑。這些必須始終是無菌的,并且只能在罩內(nèi)打開。大多數(shù)細(xì)胞系可以使用Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)培養(yǎng)基或含10%胎牛血清(FBS)的Roswell Park Memorial Institute (RPMI)培養(yǎng)基。如果需要,可以添加2mM 谷氨酰胺和抗生素。

如何準(zhǔn)備DMEM介質(zhì)

步驟程序

1.

從500mL的瓶子中取出50mL的介質(zhì)。

2.

現(xiàn)在的體積為450mL。

3.

加入10%FBS = 50mL。

4.

加入補充劑2 mM谷氨酰胺= 5mL,100 U青霉素/ 0.1mg/mL鏈霉素=5mL。


2.3 創(chuàng)造正確的培養(yǎng)環(huán)境

某些內(nèi)皮細(xì)胞系需要特殊的膠原蛋白基質(zhì)才能生長。這些基質(zhì)確保細(xì)胞系的附著、分化和生長。在開始細(xì)胞培養(yǎng)實驗之前,重要的是對目標(biāo)胞系進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)查,以確保滿足任何額外的生長要求,如基質(zhì)。請注意所用燒瓶的類型,即通氣或不通氣。如果使用非通氣/塞瓶燒瓶,請確保松開蓋子以進(jìn)行氣體交換。如果使用通氣燒瓶,請確保過濾器不會弄濕,因為這會影響氣體交換的效率。

如何為內(nèi)皮和上皮細(xì)胞制備1%明膠基質(zhì)

步驟程序

1.

通過用蒸餾水稀釋,然后過濾,制備10mL的由1%明膠/1%纖連蛋白組成的包衣溶液。

2.

這可覆蓋約5個燒瓶。

3.

吸取包衣溶液到燒瓶中

4.

來回?fù)u動以將基質(zhì)均勻分布在燒瓶上。

5.

放在培養(yǎng)箱中靜置15-30分鐘

6.

在接種前用吸氣的方法*清除包衣溶液。


2.4 檢查細(xì)胞

每天應(yīng)在顯微鏡下檢查細(xì)胞,以確保它們健康并按預(yù)期生長。熟悉顯微鏡下健康細(xì)胞的外觀非常重要,因為這將使通過形態(tài)變化檢測靜止或感染的細(xì)胞更加容易。

如果出現(xiàn)以下情況,請丟棄細(xì)胞:

步驟程序

1.

介質(zhì)從粉紅色/紅色變?yōu)榘迭S色。這是感染的跡象,并使用無菌技術(shù)。

2.

如果貼壁細(xì)胞大量脫落,則表明細(xì)胞死亡。

3.

如果細(xì)胞的外觀發(fā)生了顯著變化——看起來散亂而呈現(xiàn)顆粒狀。

4.

如果它們靜止。


2.5 分裂細(xì)胞

哺乳動物細(xì)胞匯合時應(yīng)分裂/傳代,這在燒瓶中70-80%的面積被細(xì)胞覆蓋時發(fā)生。在貼壁細(xì)胞中,當(dāng)沒有可見的空間可用于細(xì)胞生長時,可以在顯微鏡下觀察到匯合。對于懸浮細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞凝聚在一起時,可以注意到匯合,并且當(dāng)燒瓶旋轉(zhuǎn)時,培養(yǎng)基看起來會混濁。

重要的是,不要讓細(xì)胞過度匯合,以70-80%的匯合為最佳量,在這種情況下,接觸抑制作用開始生效,并且細(xì)胞在重新接種后需要更長的恢復(fù)時間。細(xì)胞系生長的速度將決定所使用的分裂比。例如,如果以高比例分裂,生長緩慢的細(xì)胞系將不能很好地發(fā)揮作用。

快速生長的細(xì)胞系可能需要較高的分裂比例,因為與生長較慢的細(xì)胞系相比,它們需要更短的時間達(dá)到匯合。通常,細(xì)胞分裂的比例不應(yīng)超過1:10,因為這對于細(xì)胞而言太低,將是細(xì)胞無法生存。改變培養(yǎng)物的接種密度可確保細(xì)胞在特定的一天準(zhǔn)備好進(jìn)行實驗。

作為通用指南,一個匯合燒瓶中的細(xì)胞:70-80%的匯合分裂比例應(yīng)為1:2,并準(zhǔn)備在1-2天進(jìn)行實驗。70-80%的匯合分裂比例應(yīng)為1:5,并準(zhǔn)備在2-4天進(jìn)行實驗。70-80%的匯合分裂比例應(yīng)為1:10,并準(zhǔn)備在4-6天進(jìn)行亞培養(yǎng)或電鍍。但這可能取決于細(xì)胞系的生長速率。

1細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋液1

2細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋液2

2.6 分裂細(xì)胞方案

步驟程序

1.

確保細(xì)胞至少匯合80%。

2.

將新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基在37℃的水浴或培養(yǎng)箱中加熱至少30分鐘。

3.

確保燒瓶正確標(biāo)有代號、細(xì)胞系、分裂比例和日期。

4.

準(zhǔn)備一個裝有漂白劑的廢料容器,以容納大約100mL的10%次氯酸鈉廢液。


2.6.1 對于松散粘附的細(xì)胞(細(xì)胞刮除)

步驟程序

1.

小心地將介質(zhì)倒入垃圾箱。

2.

在燒瓶中加入等體積的預(yù)熱新鮮培養(yǎng)基。

3.

使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞從燒瓶底部輕輕刮入培養(yǎng)基中。

4.

確保已從燒瓶上刮下所有細(xì)胞。

5.

使用血清移液器取出所需量的細(xì)胞懸液。例如,對于1:2分裂,從100mL中取出50mL倒入新的燒瓶中;對于1:5分裂,從100mL中取出20mL倒入新的燒瓶中;對于1:10分裂,從100mL中取出10mL倒入新的燒瓶中;

6.

將所需的體積(考慮分裂比例)添加到預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基中。例如在25cm2的燒瓶中加入約5-10mL;75cm2的燒瓶中加入約10-30mL;175cm2的燒瓶中加入約40-150mL。


2.6.2 對于貼壁細(xì)胞(胰蛋白酶)

步驟程序

1.

小心地將介質(zhì)從燒瓶中倒入廢液容器。

2.

使用無菌技術(shù),將預(yù)熱的PBS移液到燒瓶中,以洗滌細(xì)胞并除去任何殘留的介質(zhì)和FBS。

3.

輕輕前后搖動燒瓶,用PBS沖洗細(xì)胞,然后倒入廢液容器中。重復(fù)3次。除去任何殘留的FBS對于有效的胰蛋白酶消化很重要。

4.

洗滌完成后,添加胰蛋白酶EDTA(也已預(yù)熱)。應(yīng)該使用足夠的胰蛋白酶以覆蓋細(xì)胞。對于25cm2的燒瓶約1mL;75cm2的燒瓶約5mL;175cm2的燒瓶約10mL。

5.

像使用PBS一樣,輕輕搖動燒瓶,以確保胰蛋白酶與所有細(xì)胞接觸。

6.

將燒瓶放入37℃的培養(yǎng)箱中。不同的細(xì)胞系需要不同的胰蛋白酶消化時間。為避免過度胰蛋白酶消化嚴(yán)重破壞細(xì)胞,必須在顯微鏡下每隔幾分鐘檢查一次,同時輕敲燒瓶以使細(xì)胞脫落。

7.

一旦細(xì)胞脫落,向燒瓶中加入一些培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的FBS將使胰蛋白酶失活。

8.

輕輕地在燒瓶壁上上下移液,以去除所有其他粘附細(xì)胞。

9.

計數(shù)細(xì)胞,將所需體積的細(xì)胞移液到新的燒瓶中。然后應(yīng)在這些燒瓶中加滿培養(yǎng)基至所需體積。例如在25cm2的燒瓶中加入約5-10mL;75cm2的燒瓶中加u人約10-30mL;175cm2的燒瓶中加入約40-150mL。

10.

過夜放置細(xì)胞以使其恢復(fù)并穩(wěn)定下來。

* 胰蛋白酶消化可能對有些細(xì)胞有毒。它還可以誘導(dǎo)某些膜蛋白的暫時內(nèi)在化,在設(shè)計實驗時應(yīng)予以考慮。在這些情況下,通??梢允褂闷渌椒ǎɡ鐪睾偷募?xì)胞刮擦或使用清潔劑)代替。

2.6.3 對于懸浮細(xì)胞

步驟程序

1.

一些懸浮細(xì)胞系有建議的分裂比例或傳代細(xì)胞密度。開始實驗之前請檢查相關(guān)內(nèi)容。

2.

使用移液器從燒瓶中取出所需量的細(xì)胞懸液,然后放入新的燒瓶中。例如,對于1:2分裂,從100mL細(xì)胞懸液中取出50mL;對于1:5分裂,從100mL細(xì)胞懸液中取出20mL

3.

將所需量的預(yù)熱細(xì)胞培養(yǎng)基添加到新鮮的燒瓶中。例如,對于1:2分裂,從100mL細(xì)胞懸液中取出的50mL,加入50mLs的新鮮介質(zhì)。對于1:5分裂,從100mL細(xì)胞懸液中取出的20mL,加入80mLs的新鮮介質(zhì)。


2.7 更換介質(zhì)

如果細(xì)胞已經(jīng)生長了幾天,但匯合程度不足以分裂,則必須更換介質(zhì)以補充營養(yǎng)并保持pH值。

對于貼壁細(xì)胞

步驟程序

1.

在水浴箱或培養(yǎng)箱中使用介質(zhì)之前,對其預(yù)熱至少30分鐘。

2.

將舊介質(zhì)倒入垃圾箱。

3.

用相同體積預(yù)熱過的新培養(yǎng)基更換,然后放回培養(yǎng)箱。

 

對于懸浮細(xì)胞

步驟程序

1.

在水浴箱或培養(yǎng)箱中使用介質(zhì)之前,對其預(yù)熱至少30分鐘。

2.

將含有細(xì)胞的介質(zhì)倒入15mL或50mL的離心管中并離心。轉(zhuǎn)速和離心時間可能會因細(xì)胞系而異。

3.

離心后,細(xì)胞應(yīng)會沉淀在管的底部,將舊介質(zhì)倒入廢物中,然后將沉淀重新懸浮在相同體積的介質(zhì)中。

4.

放入新鮮的燒瓶中,并放回培養(yǎng)箱。


2.8 傳代數(shù)

傳代數(shù)是細(xì)胞經(jīng)歷的傳代培養(yǎng)的次數(shù)。應(yīng)記錄傳代數(shù)并且傳代數(shù)不應(yīng)太高。與低傳代細(xì)胞相比,傳代數(shù)大于30的細(xì)胞系更有可能獲得遺傳異常(Esquenet et al., 1997; Lin et al., 2003; O’Driscoll et al., 2006)。

P30通常被認(rèn)為是培養(yǎng)中某些細(xì)胞傳代的上限,因為進(jìn)一步培養(yǎng)可能會導(dǎo)致分子譜的顯著變化,限制其在體內(nèi)的應(yīng)用和可重復(fù)性(Calles et al., 2006; O’Driscoll et al., 2006; Wenger et al., 2004)。

2.9 冷凍細(xì)胞

冷凍細(xì)胞系是細(xì)胞培養(yǎng)的重要組成部分,因為更換細(xì)胞系既昂貴又費時,而且還可以確保如果細(xì)胞被感染,還將擁有備用庫存并可以重新開始。一旦有多余的細(xì)胞可用,最好是低傳代數(shù)以限制遺傳漂變,就應(yīng)將其冷凍為接種庫存。然后可以從接種庫存中準(zhǔn)備使用的細(xì)胞。

冷凍保存細(xì)胞的最佳和*泛使用的方法是將它們保存在帶有冷凍保護(hù)劑,例如二甲基亞砜(DMSO)的液氮中。冷凍保護(hù)劑(例如DMSO)降低了培養(yǎng)基的凝固點并降低了冷卻速度,從而大大降低了冰晶形成的風(fēng)險,而該冰晶會導(dǎo)致細(xì)胞死亡和損壞。配置細(xì)胞凍存液需要培養(yǎng)基,血清和DMSO,按照一定比例配置。費事費時費力。靶點科技有現(xiàn)成直接使用的Bambanker無血清細(xì)胞凍存液(貨號BB01),可以直接放到-80,無需梯度程序降溫。

冷凍細(xì)胞方案

步驟程序

1.

通過細(xì)胞計數(shù)和所需的冷凍培養(yǎng)基體積確定活細(xì)胞總數(shù)。

2.

離心細(xì)胞懸液。離心速度和持續(xù)時間會因細(xì)胞類型而異。

3.

不干擾沉淀的情況下,將上清液倒入廢物中。

4.

根據(jù)特定細(xì)胞類型建議的活細(xì)胞密度,將沉淀重懸于冷的冷凍培養(yǎng)基中。

5.

將細(xì)胞懸液分裝到低溫儲存瓶中,清楚標(biāo)明日期、細(xì)胞類型和傳代號。

6.

在控制速率的冷凍設(shè)備中冷凍細(xì)胞,每分鐘降低溫度約1℃?;蛘?,將含有細(xì)胞的冷凍管放在異丙醇室中,并在–80℃下儲存過夜。

7.

將冷凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中,并在液氮上方的氣相中進(jìn)行存儲。

*以盡可能高的濃度和盡可能低的傳代數(shù)冷凍培養(yǎng)的細(xì)胞。冷凍之前,請確保至少有90%的細(xì)胞能夠存活。始終使用無菌冷凍管保存冷凍細(xì)胞。始終使用適當(dāng)?shù)臒o菌技術(shù),并在層流罩中工作。

安全注意事項:使用DMSO時應(yīng)格外小心,因其會促進(jìn)有機分子進(jìn)入組織。處理該試劑時,請戴手套并穿著適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)服。按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處理試劑。


2.10 解凍冷凍細(xì)胞

解凍細(xì)胞對冷凍細(xì)胞的壓力*,因此與冷凍細(xì)胞應(yīng)緩慢進(jìn)行冷凍不同,解凍細(xì)胞應(yīng)盡可能快地進(jìn)行,以確保細(xì)胞的高存活率。

解凍細(xì)胞方案

步驟程序

1.

小心從液氮中取出細(xì)胞

2.

立即迅速解凍冷凍的細(xì)胞

3.

冰融化后,轉(zhuǎn)移到層流罩中。

4.

將已解凍的細(xì)胞逐滴轉(zhuǎn)移到裝有所需已預(yù)熱培養(yǎng)基的離心管中。

5.

離心細(xì)胞懸液。離心速度和持續(xù)時間會因細(xì)胞類型而異。

6.

離心后,除去上清液并攪動沉淀。

7.

小心地重懸于新鮮培養(yǎng)基中,并轉(zhuǎn)移至合適的燒瓶大小并進(jìn)行孵育。


2.11 支原體檢測

細(xì)胞培養(yǎng)實驗室中最常見的污染物之一是支原體。支原體是一種缺乏細(xì)胞壁的基本細(xì)菌,被認(rèn)為是最小的自我復(fù)制生物。由于支原體的尺寸很?。ù蠹s> 1µm),因此很難檢測到,直到達(dá)到*的密度并導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物變質(zhì)才會知道它們的存在。

許多生長緩慢的支原體可以在未檢測到的培養(yǎng)物中持續(xù)存在而不會引起細(xì)胞死亡,但是,它們可以改變培養(yǎng)物中宿主細(xì)胞的行為和代謝。慢性支原體感染也可能導(dǎo)致懸浮培養(yǎng)物中細(xì)胞增殖速率降低,飽和密度降低和凝集。檢測此類支原體感染的方法是定期檢測細(xì)胞培養(yǎng)物;熒光染色(例如Hoechst)、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或微生物測定。

2.11.1 使用抗生素

應(yīng)謹(jǐn)慎使用細(xì)胞培養(yǎng)中的抗生素。連續(xù)使用抗生素會增強抗生素耐藥性,允許存在低水平的污染并掩蓋各種污染物。一些抗生素還可以與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)并干擾正在研究的細(xì)胞過程。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)實驗室根據(jù)研究機構(gòu)和研究領(lǐng)域的不同而有很大差異。但是,所有細(xì)胞培養(yǎng)實驗室確實都具有一些的通用設(shè)備和要求,其中最重要的是保持無菌的病原體環(huán)境。以下是可在更多細(xì)胞培養(yǎng)實驗室中使用的常見設(shè)備和材料的列表。此列表并不完整,根據(jù)研究領(lǐng)域的不同可見其中的偏差。

基本設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)實驗室根據(jù)研究機構(gòu)和研究領(lǐng)域的不同而有很大差異。但是,所有細(xì)胞培養(yǎng)實驗室確實都具有一些的通用設(shè)備和要求,其中最重要的是保持無菌的病原體環(huán)境。以下是可在更多細(xì)胞培養(yǎng)實驗室中使用的常見設(shè)備和材料的列表。此列表并不完整,根據(jù)研究領(lǐng)域的不同可見其中的偏差。

  • 細(xì)胞培養(yǎng)罩(即層流罩或生物安全柜)
  • 保溫箱(建議使用潮濕的CO2保溫箱)
  • 水浴
  • 離心機
  • 冰箱和冰柜(–20℃)
  • 細(xì)胞計數(shù)器(自動細(xì)胞計數(shù)器或血細(xì)胞計數(shù)器)
  • 倒置顯微鏡
  • 液氮(N2)冰箱或冷凍儲藏容器
  • 細(xì)胞培養(yǎng)容器(例如燒瓶、培養(yǎng)皿、滾瓶、多孔板)
  • 移液器
  • 注射器和針頭
  • 垃圾箱
  • 培養(yǎng)基、血清和試劑
  • 細(xì)胞
 
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